ABORLccfRevista Brasileira de Otorrinolaringologia

Trabalho Experimental

Ototoxicidade x Toxicidade sistêmica por cisplatina em um modelo experimental em rato...
Ototoxicity x Systemic toxicity of cisplatin in a rat model...

Autores:

MARCOS RABELO DE FREITAS.. (DOUTOR..)

Sérgio Tadeu Almeida Pereira.. (Médico Otorrinolaringologista..)

Gerly Anne de Castro Brito.. (Pós-Doutorado pela University of Virginia, UVA, Estados Unidos. Doutorado em Farmacologia pela Universidade Federal do Ceará..)

José Valdir de Carvalho Júnior.. (Acadêmico do curso de Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará..)

Raimundo Martins Gomes Júnior.. (Acadêmico do curso de Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará..)

Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.. (Doutor em Farmacologia pela Universidade de São Paulo. ..)

Palavras-Chave
ototoxicidade; toxicidade sistêmica; cisplatina; potenciais auditivos evocados de tronco encefálico..

Resumo
Cisplatina (cis-diaminodicloroplatinum) é um quimoterápico bastante usado para o tratamento de várias linhagens de neoplasias, especialmente as de cabeça e pescoço. Todavia, a ototoxicidade permanece sendo um de seus efeitos colaterais causadores de significativa morbidade e que freqüentemente limita sua utilização. O presente estudo teve como objetivo, desenvolver um modelo experimental em rato que fosse viável para estudos de ototoxicidade por cisplatina. Material e Método: Foram utilizados ratos Wistar machos, aos quais se administrou cisplatina por via intraperitoneal (IP) nas doses de 24 mg/kg, fracionada em três doses diárias de 8 mg/kg ou 16 mg/kg em infusão única. A avaliação funcional da audição realizou-se através de potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE) no terceiro (D3) e quarto (D4) dias após o início da infusão das drogas. A toxicidade sistêmica foi avaliada através de parâmetros objetivos como perda de peso e taxa de sobrevida. Resultados: Os animais tratados, diferente de seus controles, apresentaram uma significativa redução de peso a partir do primeiro ou segundo dia após a administração das drogas. A mortalidade foi baixa até o terceiro dia, mas aumentou significativamente no quarto dia. As doses de 16 mg/kg e 24mg/kg de cisplatina acarretaram aumento de limiar eletrofisiológico no D3 e D4. Conclusão: Através deste estudo, verificamos que, em ratos, a dose fracionada de 24 mg/kg ou de 16mg/Kg em infusão única de cisplatina, seguida de avaliação funcional da audição por PAETE no terceiro dia após sua administração, constitui-se em um modelo viável para estudos de ototoxicidade por esta droga...

Keywords
ototoxicity; systemic toxicity; cisplatin; brainstem evoked response audiometry..

Abstract
Cisplatin (cis-diamminedicloroplatinum) is an antineoplastic drug frequently used in the treatment of several lineage of cancers, specially head and neck tumors. Nevertheless, ototoxicity remains one of its common side-effects that causes a significant morbidity and limits its use. The aim of this study was the development of a experimental model in rat that would be able to study the ototoxicity as a side-effect of cisplatin. Methods: Male Wistar rats were intraperitoneally (i.p.) treated with 24 mg/kg of cisplatin, which was divided into three equal doses (8 mg/kg) or a single i.p. administration of 16 mg/kg. The animals were evaluated with brainstem evoked response audiometry (BERA) on the 3rd and 4th days after cisplatin injection.The systemic toxicity was evaluated by objective parameters such body weigh loss and mortality rate. Results: Treatment with cisplatin caused a significant body weigh loss starting on the 1st or 2nd days when compared to non-treated animals. The mortality rate remained low until the 3rd day with significant enhance on day 4. Both doses of cisplatin, 16mg/kg and 24mg/kg, resulted in an increase of the hearing threshold detected by BERA on day 3 and 4. Conclusion: The study suggests that in rats, the intraperitoneal injection of cisplatin 24 mg/kg, divided into 3 equal doses, or 16 mg/kg single dose, followed by functional hearing evaluation with BERA on the 3rd day after the beginning of the administration, consists in a viable model for the study of the ototoxicity of this drug...

 

Instituição: Faculdade de Medicina da Univerdidade Federal do Ceará

Suporte Financeiro:

INTRODUÇÃO

 

A cóclea é a estrutura neurossensorial fundamental no processo auditivo periférico da mensagem acústica. É formada por uma série de estruturas epiteliais complexas, com células sensoriais e de sustentação, situadas sobre a membrana basilar 1. Seu dano, quase sempre irreversível, poderá ter conseqüências funestas para o indivíduo acometido, que pode ver comprometida sua capacidade de comunicação, com sérios transtornos ao convívio social. Por outro lado, apesar do potencial ototóxico de algumas drogas antineoplásicas e, entre elas, a cisplatina, não se deve desprezá-las como uma alternativa terapêutica para o paciente portador de uma neoplasia maligna. Daí a importância de se determinar com exatidão os mecanismos através dos quais ocorrem os efeitos ototóxicos de tais drogas, para se buscar estratégias de redução dessa toxicidade, sem comprometer seu efeito terapêutico 2.

Cisplatina (cisdiaminodicloroplatinum) é um agente quimioterápico freqüentemente usado para o tratamento de várias linhagens de neoplasias, mormente as de cabeça e pescoço 3. Foi sintetizada, em 1844, em Turim, por Mychele Peyrone, possuindo propriedades antiproliferativas que foram primeiramente observadas em 1965 por Barnett Rosenberg na Universidade do estado de Michigan, EUA4. Em 1971, pela primeira vez, foi administrada a um paciente com câncer e tornou-se disponível para a prática oncológica geral em 19785. O mecanismo de ação antineoplásico está relacionado à inibição seletiva e persistente da síntese de ácido desoxiribonucleico (DNA)6. Seus efeitos colaterais incluem ototoxicidade, nefrotoxicidade, supressão medular e distúrbios gastrointestinais7. Estes tipos de toxicidade podem interferir com o tratamento ao reduzir a dosagem, freqüência e duração da quimioterapia em muitos pacientes8.

 

A ototoxicidade por cisplatina foi primeiramente descrita por Rossof et al., em 1972, e tem sido amplamente estudada desde então9. Sua incidência parece variar entre 4 e 50%10, embora alterações na audiometria de alta freqüência possam ser evidenciadas na quase totalidade dos casos11. Pacientes avaliados por audiometria tonal liminar convencional têm sua perda de audição caracterizada pela simetria, predominando entre 4 e 8 kHz e variando entre 15 e 65 dB NA12. O grau de perda de audição depende da dose e da freqüência de administração desse agente. Deficiência auditiva em audiometria de altas freqüências (> 8 kHz) está presente em doses maiores ou iguais a 120 mg/m2 13. A administração em bolo em adultos causa danos ototóxicos mais intensos14. Outros fatores que influenciam o grau de perda auditiva incluem idade (crianças e idosos são mais susceptíveis), maior número de ciclos quimioterápicos, ingesta prévia de outras drogas como furosemida e ácido etacrínico, presença associada de disfunção renal e susceptibilidade individual15. Em adição, devido ao estoque de cisplatina no corpo durante anos, uma deficiência auditiva progressiva pode permanecer   mesmo  após    a   suspensão   do   tratamento 16.

Estudos em animais têm demonstrado que a administração de cisplatina resulta em degeneração do órgão espiral de Corti, com perda completa ou parcial de células ciliadas externas e, esporadicamente, de células ciliadas internas 17,18. A lesão se inicia nos giros basais da cóclea, estendendo-se progressivamente até atingir o giro apical 17,18,19,20. Em adição aos efeitos ototóxicos da cisplatina sobre o órgão de Corti, há evidências de comprometimento da estria vascular 18,19,20, gânglio espiral18,19,20 e membrana vestibular de Reissner18.

Diferentes doses e formas de administração são utilizadas para atingir os efeitos ototóxicos em roedores. A via de administração mais comumente empregada é a intraperitoneal (IP). Outras vias são artéria carótida21, veia jugular interna 22, subcutânea23, intramuscular24, intralabiríntica25 e sobre a janela redonda26.  É bem conhecido que os efeitos crônicos da cisplatina são menos pronunciados que os efeitos agudos24. Em experimentos com administração crônica da droga, a literatura sugere que se pode esperar um efeito ototóxico da cisplatina em cobaias albinas a partir do oitavo dia da administração de 1,5 a 2,0 mg/kg/dia27. Em ratos Sprague-Dawley, regime crônico de 2,5 mg/kg/semana, em seis semanas, consecutivas foi empregado mostrando algum grau de ototoxicidade28. Para experimentos com administração aguda da droga, doses maiores ou iguais a 8 mg/kg têm mostrado graus mensuráveis de ototoxicidade22. Detalhe importante é a administração lenta da droga (30 min) através de bombas de infusão para diminuir a taxa de mortalidade em doses a partir de 13 mg/kg29. Mais recentemente, experimentos de Hyppolito et al. (2005)30 conseguiram desencadear ototoxicidade por cisplatina em cobaias albinas com uma dose cumulativa de 24 mg/kg, dividida em 3 doses diárias de 8 mg/kg, sem a necessidade do uso de bomba de infusão. Minami, Sha e Schacht (2004)31 propuseram um modelo de ototoxicidade por CDDP em ratos Fischer 344 em 2 ciclos. O primeiro ciclo consistia da administração de 1 mg/kg da droga, duas vezes ao dia, durante quatro dias. Seguia-se um repouso de dez dias após o qual se repetia a administração nos quatro dias subseqüentes.  O tempo final de avaliação da ototoxicidade aguda varia entre os experimentos de 1 a 14 dias22 na dependência da via de administração e da dose empregadas.

Este tipo de lesão parece resultar de dano de vários tecidos mediado por radicais livres17. Tem sido demonstrado que espécies reativas de oxigênio são geradas na cóclea após exposição à cisplatina32 e o estresse oxidativo pode provocar a morte de células cocleares por apoptose secundário à ativação de caspase-333.

São diversas as maneiras de se avaliar o comprometimento funcional da audição em animais de laboratório, variando desde métodos simples como o reflexo de Preyer1, até métodos mais sofisticados e dispendiosos como os potenciais auditivos evocados de tronco encefálico34,35, eletrococleografia18,27 e emissões otoacústicas evocadas7,35. As emissões otoacústicas (EOA) e os potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE), com larga aplicação na prática clínica, são os métodos ultimamente mais empregados para estudo da ototoxicidade por cisplatina em roedores.

Baseados nesses pressupostos, dispusemo-nos a desenvolver um modelo experimental em ratos para estudo de ototoxicidade por cisplatina, através de métodos de avaliação funcional que tivesse reprodutibilidade e que pudesse abrir caminhos para o estudo dos mecanismos envolvidos na lesão coclear por drogas ototóxicas e da otoproteção. Foi realizado também, avaliação da toxicidade sistêmica por cisplatina em ratos, tendo como base a perda de peso e a taxa de sobrevida, uma vez que poderiam inviabilizar o modelo de estudo proposto.

 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVOS

 

Desenvolver um modelo de ototoxicidade por cisplatina em ratos, utilizando potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE) para sua avaliação, como também, avaliar a toxicidade sistêmica por cisplatina no modelo proposto.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

 

Foram utilizados para o estudo ratos Wistar machos provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, com peso variando entre 200 e 348g, mantidos em gaiolas com livre acesso a alimentos e água, em ciclos naturais de sono e vigília, e manuseados segundo as normas preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), encontradas no sítio www.cobea.org.br. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais (CEPA) da Faculdade de Medicina.

Critérios de Exclusão

·   Animais fora da faixa de peso previamente estabelecida (200 a 350g), correspondendo a idade de adultos jovens.

·   Animais com sinais ao exame otoscópico de doença de orelha externa, tais como, edema e hiperemia de conduto auditivo externo, tumorações ou rolha de cerume impactada.

·   Animais com sinais de doença da orelha média, tais como opacificação, abaulamento e hiperemia de membrana timpânica, ou perfuração dessa membrana.

·   Animais com limiar eletrofisiológico estabelecido por potencial auditivo evocado de tronco encefálico maior que 10 dB NA, antes do início da administração das drogas.

 

 

Drogas

 

1.      Cisplatina

·   Cisplatex - Laboratório Eurofarma 50 mg - pó liofilizado para solução injetável.  

·   Preparo: 50 mg do pó liofilizado diluídos em 50 ml de solução salina, constituindo uma concentração final de 1 mg/ml.

 

2. Solução salina fisiológica 0,9%

 

3. Ketamina

·   Vetarnacol - Laboratório König 50mg/ml.

 

4. Xilazina

·    Kensol - Laboratório König 20 mg/ml.

 

Grupos (n = número de ratos)

a) Grupo 1 (CDDP 24) (n=11)

Ratos tratados com cisplatina na dose de 8 mg/kg/dia em 3 dias consecutivos (total de 24 mg/kg) e avaliados antes do tratamento (D0), três (D3) e quatro dias (D4) após o seu início por potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE).

 

b) Grupo 2 (C 24) (n=7)

Ratos tratados com solução salina na dose de 8 ml/kg/dia em 3 dias consecutivos (total de 24 ml/kg) e avaliados antes do tratamento (D0), três (D3) e quatro dias (D4) após o seu início por potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE).

 

c) Grupo 3 (CDDP 16) (n=12)

Ratos tratados com cisplatina em dose única de 16 mg/kg/dia e avaliados antes do tratamento (D0), três (D3) e quatro dias (D4) após o seu início por potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE).

 

d) Grupo 4 (C 16) (n=8)

Ratos tratados com solução salina em dose única de 16 ml/kg/dia e avaliados antes do tratamento (D0), três (D3) e quatro dias (D4) após o seu início por potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE).

 

Procedimento

Os ratos Wistar foram submetidos a anestesia profunda com ketamina 50 mg/kg associada a xilazina 10 mg/kg. Uma otoscopia prévia foi realizada eliminando-se os animais com sinais de afecções de orelha externa ou média, como detalhado nos critérios de exclusão. Aqueles com otoscopia normal se submeteram a exame de Potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE), imediatamente antes da administração das drogas. Nos grupos cisplatina 8 mg/kg em 3 dias consecutivos ou solução salina 8 ml/kg em 3 dias consecutivos, as drogas eram injetadas por via intraperitoneal logo após a conclusão da avaliação auditiva. Nos dois dias subseqüentes, depois de nova pesagem dos ratos, cisplatina 8 mg/kg ou solução salina 8 ml/kg eram novamente administradas, para resultar em uma dose final respectivamente de 24 mg/kg e 24 ml/kg. Vinte e quatro (D3) ou 48h (D4) depois da última administração, os ratos eram novamente anestesiados, era realizada uma outra otoscopia para descartar aqueles que adquiriram doenças de orelha média ou externa durante o período de administração das drogas, e eram submetidos a nova avaliação auditiva por PAETE. Nos grupos em que a cisplatina foi injetada por via intraperitoneal na dose única de 16 mg/kg e a salina 16 ml/kg, utilizou-se uma bomba de infusão de marca Kd Scientific série 100 para que o tempo de infusão fosse fixado em 30min. Quando necessário, nova dose dos anestésicos era injetada. A avaliação auditiva também foi realizada no terceiro (D3) ou quarto (D4) dias após a administração das drogas.

Avaliação Funcional da Audição

Utilizou-se, para realização do exame, aparelho Interacoustic EP 25, localizado em ambiente silencioso. Com os animais anestesiados, eletrodos subdérmicos de platina foram posicionados no vértex (positivo), região retroauricular direita (negativo) e ponta do nariz (terra). Fones de inserção ER-3A acoplados a uma sonda utilizada para avaliação auditiva de recém-nascidos foram introduzidos no conduto auditivo externo direito dos ratos. Os estímulos empregados foram cliques de rarefação, liberados a uma taxa de 15 por segundo, com um total máximo de 700 promediações e um tempo de análise de 15 mseg. A banda passante utilizada foi de 0 a 3000 Hz. Os estímulos foram iniciados em 80 dB NA e diminuídos progressivamente até o desaparecimento completo das ondas. Para o limiar auditivo eletrofisiológico, foi considerada a menor intensidade de estímulo em que se evidenciava onda II.

Análise Estatística

Foi utilizado, para confecção dos gráficos e análise estatística, o programa GraphPad Prism 4.00.255. Foi avaliada a distribuição normal da amostra através do teste de Komogorov-Smirnov. Os resultados forma expressos como média ± o erro padrão da média (MED ± EPM), para os dados contínuos, e como mediana (Md) e valores mínimo (Min) e máximo (Max) para os dados ordinais. A significância mínima aceita foi ao nível de 5%. Os vários procedimentos experimentais foram comparados utilizando-se os seguintes testes:

a)  Teste t de Student (quando possível usado com emparelhamento)

  • Comparar as médias dos limiares eletrofisiológicos dos animais obtidos através de potencial auditivo evocado de tronco encefálico entre o primeiro (D0) e o quarto dias (D3), nos grupos controle (salina), cisplatina 16 mg/kg e cisplatina 24 mg/Kg.
  • Comparar a variação média do peso dos animais entre os grupos tratamento e controle, em cada dia do experimento.

 

b) Análise de Variância (ANOVA) Com a Significância Entre os Grupos Estabelecida Pelo Teste de Tukey

  • Comparar a variação do peso dos animais nos grupos 9, 10 e 13, até o quarto dia do experimento. 
  • Comparar as médias dos limiares eletrofisiológicos dos animais obtidos através de potencial auditivo evocado de tronco encefálico entre o primeiro (D0), quarto (D3) e quinto (D4) dias da avaliação.
  • Comparar as médias dos valores do intervalo I-V obtidos através de potencial auditivo evocado de tronco encefálico entre o primeiro (D0), quarto (D3) e quinto (D4) dias da avaliação.

c)   Teste de Logranks

  • Comparar as curvas de sobrevivência entre os diversos grupos dois a dois.

 

d)  Teste exato de Fisher

·   Comparar a mortalidade no último dia de avaliação nos animais tratados com cisplatina.

 

RESULTADOS

- Alterações de Orelha Média ou Externa

Um animal no grupo 3 (CDDP 16) apresentou alterações de orelha média à otoscopia após o início do experimento, sendo, assim, eliminado do estudo. Nenhuma alteração de orelha externa se desenvolveu durante o experimento.

- Toxicidade Sistêmica da Cisplatina

  Variação do peso

  • Grupo 1 (CDDP 24) X Grupo 1 (C 24)

Encontrou-se uma diminuição significativa do peso dos animais tratados com cisplatina em relação ao dia correspondente do grupo controle, a partir do segundo dia após o início da administração da droga (TABELA 1; FIGURA 1).

 

Tabela 7 - Variação do peso em função dos dias nos grupos 1 e 2

GRUPOS

DIAS

D1

D2

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

1.CDDP  24

98,81

0,4108

93,08*

0,8691

87,95**

1,416

88,87***

1,516

2.C 24

97,84

0,5820

98,10

0,8469

98,54

0,8623

96,88

1,087

 

TABELA 1 - Média ± erro padrão da média (MED ± EPM) da variação do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 1 e 2 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento.  Os asteriscos representam diferença estatística significativa em cada dia do grupo estudo (1) em relação ao seu controle (2). Teste T: * p = 0,0012 (D2 x D2 controle); ** p < 0,0001 (D3 x D3 controle); *** p = 0,0013 (D4 x D4 controle).

 

 

·   Grupo 3 (CDDP 16) X Grupo 4 (C 16)

Semelhante ao que se viu no grupo de ratos injetados com a dose de 24 mg, houve uma diminuição significativa do peso dos animais tratados com cisplatina 16 mg em relação ao dia correspondente do grupo controle, a partir do segundo dia após o início da administração da droga (TABELA 2; FIGURA 2).

Tabela 2 - Variação do peso em função dos dias nos grupos 3 e 4

GRUPOS

DIAS

D1

D2

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

3.CDDP 16

97,50

0,5590

92,09*

0,5989

86,25**

1,024

85,13***

0,7994

4.C 16

98,44

0,6974

98,32

0,5954

99,19

0,4337

96,75

0,5717

 

TABELA 2 - Média ± erro padrão da média (MED ± EPM) da variação do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 3 e 4 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento.  Os asteriscos representam diferença estatística significativa em cada dia do grupo estudo (3) em relação ao seu controle (4). Teste T: * p < 0,001 (D2 x D2 controle); ** p < 0,0001 (D3 x D3 controle); *** p < 0,001 (D4 x D4 controle).

 

 

·   Grupo 1 (CDDP 24) X Grupo 3 (CDDP 16)

Observou-se uma redução do peso dos animais com as doses de 24 e 16 mg de CCPD com um padrão semelhante. A exceção foi encontrada no D4, quando se viu uma redução de peso significativamente maior nos animais tratados com a dose de 16 mg/kg (TABELA 3; FIGURA 3).

Tabela 3 - Variação do peso em função dos dias nos grupos 1 e 3

GRUPOS

DIAS

D1

D2

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

1.CDDP  24 

98,81

0,4108

93,08

0,8691

87,95

1,416

88,87*

1,516

3. CDDP 16

97,50

0,5590

92,09

0,5989

86,25

1,024

85,13

0,7994

 

TABELA 3 - Média ± erro padrão da média (MED ± EPM) da variação do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 1 e 3 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento.  O asterisco representa diferença estatística significativa entre o D4 do grupo de 24 mg/kg versus o D4 do grupo de 16 mg/kg (Teste T; * p = 0,0397).

 

 

 

Curvas de sobrevida e mortalidade geral

·   Curva de sobrevida dos animais tratados com CDDP e seus respectivos controles imediatamente antes e no terceiro (D3) e quarto (D4) dias após o início da administração das drogas.

Foi observado nos animais do grupo 1 (CDDP 24) uma sobrevida média significativamente menor que o seu controle (Grupo 2), a expensas de mortalidade no D4 da experimentação. Não houve diferença estatisticamente significativa nas curvas de sobrevida dos animais tratados com 24 mg/kg ou 16 mg/kg (TABELA 4; FIGURA 4).

Tabela 4 - Teste de Logrank entre os grupos 1, 1, 3 e 4

GRUPOS

1.

2.

3.

4.

1. CDDP 24

-

0,0293

0,4922

0,1041

2. C 24

0,0293

-

0,0792

0,3496

3. CDDP 16

0,4922

0,0792

-

0,2546

4. C 16

0,1041

0,3496

0,2546

-

 

TABELA 4 - Valor descritivo do Teste Logrank para a comparação da sobrevida de dois a dois os grupos dos animais submetidos a PAETE. Os números correspondem ao valor de p. Em vermelho estão representados os que mostraram diferença significativa. CDDP = cisplatina. C = controle.

 

 

 

Taxa de sobrevida entre os grupos tratados com cisplatina

 

·   Taxa de sobrevida entre os animais tratados com cisplatina

A sobrevida menor se deu quando se avaliou os animais no D4, embora não se tenha visto diferença estatística significativa entre os diversos grupos e fases de avaliação (Teste exato de Fischer p > 0,05) (TABELA 5).

 

Tabela 5 - Taxa de sobrevida final

GRUPOS

SOBREVIDA FINAL (%)

D3

D4

CDDP 24 mg

96,97

52,89

CDDP 16 mg

97,43

67,45

 

TABELA 5 - Taxa de sobrevida final entre os animais tratados com cisplatina (CDDP). Não houve diferença significativa da sobrevida final nos diversos grupos.

 

 

Avaliação funcional da audição por potencial auditivo evocado de tronco encefálico (PAETE)

·   Grupo 1 (CDDP 24) X Grupo 2 (C 24)

Houve um aumento significativo do limiar médio eletrofisiológico dos animais injetados com cisplatina 24 mg/kg no D3 e D4 quando comparados ao D0. Não foi notada diferença estatística significativa desses limiares entre D3 e D4. No grupo controle não houve elevação dos limiares eletrofisiológicos (TABELA 6, FIGURA 5). Não se encontrou diferença estatística significativa do intervalo I-V entre os dias em ambos os grupos (TABELA 7; FIGURA 6).

Tabela 6 - Variação do limiar por paete nos grupos 1 e 2.

GRUPOS

LIMIAR (dB NA)

D0

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

1. CDDP 24

8

0,816

20*

2,981

29*

5,339

2. C 24

5

0,000

5

0,000

5

0,000

 

TABELA 6 - Limiar eletrofisiológico dos animais nos grupos 1 e 2 em D0, D3 e D4 expressos como média ± erro padrão da média (MED ± EPM). O asterisco representa diferença estatística significativa. ANOVA - Tukey: * p < 0,01 (D3 x D0 CDDP); * p < 0,001 (D4 x D0 CDDP).

 

 

 

Tabela 7 - Variação do intervalo I-V  nos grupos 1 e 2

GRUPOS

INTERVALO I-V (mseg)

D0

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

1. CDDP 24

3,31

0,0600

3,50

0,0630

3,64

0,217

2. C 24

3,40

0,1097

3,49

0,0870

3,65

0,0562

 

TABELA 7 - Média ± erro padrão da média (MED ± EPM) do intervalo I-V dos animais nos grupos 1 e 2 nos dias D0, D3 e D4. Não foi encontrada diferença estatística entre os dias nos 2 grupos. ANOVA p > 0,05.

 

 

 

 

·   Grupo 3 (CDDP 16) X Grupo 4 (C 16)

Foi evidenciado um aumento significativo do limiar médio eletrofisiológico dos animais injetados com cisplatina 16 mg/kg no D3 quando comparados ao D0. Não foi notada diferença estatística significativa desses limiares entre D3 e D4. No grupo controle também não houve elevação dos limiares eletrofisiológicos (TABELA 8, FIGURA 8). Não se encontrou ainda diferença estatística significativa do intervalo I-V entre os dias em ambos os grupos (TABELA 9; FIGURA 9).

Tabela 8 - Variação do limiar por PAETE nos grupos 3 e 4

GRUPOS

LIMIAR (dB NA)

D0

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

3. CDDP 16

5,83

0,5618

20*

4,472

20

6,726

4. C 16

5,71

0,7143

5,71

0,7143

5,71

0,7143

 

TABELA 8 - Limiar eletrofisiológico dos animais nos grupos 3 e 4 em D0, D3 e D4 expressos como média ± erro padrão da média (MED ± EPM). O asterisco representa diferença estatística significativa. ANOVA - Tukey: * p < 0,05 (D3 x D0 CDDP).

 

 

 

Tabela 9 - Variação do intervalo I-V nos grupos 3 e 4

GRUPOS

INTERVALO I-V (mseg)

D0

D3

D4

MED

EPM

MED

EPM

MED

EPM

3. CDDP 16

3,26

0,0543

3,46

0,0718

3,36

0,0932

4. C 16

3,50

0,0726

3,37

0,0430

3,50

0,0926

 

TABELA 9 - Média ± erro padrão da média (MED ± EPM) do intervalo I-V dos animais nos grupos 3 e 4 nos dias D0, D3 e D4. Não foi encontrada diferença estatística entre os dias nos 2 grupos. ANOVA p > 0,05.

 

 

DISCUSSÃO

 

A cisplatina é um dos mais largamente usados e mais efetivos quimioterápicos contra tumores malignos epiteliais, incluindo tumores de testículo, ovário, vesícula, pulmão, cabeça e pescoço36. Alguns de seus efeitos adversos, tais como náuseas, vômitos e disfunção renal, podem ser combatidos com o uso de antagonistas de receptores da serotonina e hidratação31. Contudo, a ototoxicidade permanece sendo um dos efeitos colaterais causadores de significativa morbidade e que freqüentemente limita sua utilização37. Diante disso, há a necessidade de se desenvolver modelos experimentais que levem a uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ototoxicidade da CDDP e maneiras viáveis de amenizá-la.

O objetivo principal desse estudo foi desenvolver um modelo experimental de ototoxicidade por cisplatina que pudesse ser realizado nas condições de infra-estrutura aqui existentes. Assim, apesar da maioria dos trabalhos levantados na literatura terem como animal de experimentação a cobaia albina, resolveu-se desenvolver o modelo em ratos Wistar pela maior disponibilidade dessa espécie nos biotérios aos quais se tinha acesso.

O rato é um animal menos sensível à ototoxicidade e mais sensível à toxicidade sistêmica por cisplatina quando comparado à cobaia albina. O estudo de Sockalingam et al. (2000)35 mostrou que ratos albinos injetados com 12 mg/kg via intraperitoneal de cisplatina apresentaram maior percentagem de perda de peso, diarréia e anorexia que cobaias albinas submetidas à mesma dose. Por outro lado, cobaias albinas tiveram maior susceptibilidade à perda de audição que ratos albinos, como comprovado por emissões otoacústicas evocadas transitórias e produtos de distorção e por potencial auditivo evocado de tronco encefálico.

Não se encontraram relatos de desenvolvimento de infecção de orelha média ou externa durante os experimentos animais com cisplatina na literatura pesquisada. Neste estudo, observou-se o aparecimento de alterações à otoscopia caracterizada por membrana timpânica opaca e abaulada em 1 animal no grupo estudo. Assim, apesar da grande dificuldade de seleção da amostra pela prevalência elevada de doenças de orelha externa e média entre os ratos disponibilizados para os experimentos, não foi comum o aparecimento dessas afecções após o seu início. Essa dificuldade de seleção também foi o motivo pelo qual não houve uma maior homogeneidade no número de animais entre os grupos.

As doses empregadas são bastante variáveis entre os modelos experimentais com ototoxicidade por CDDP. Sabe-se, entretanto, que os modelos com administração aguda promovem lesão mais pronunciada que aqueles com administração crônica da droga24. Por isso, o presente estudo foi realizado com protocolos de administração aguda da cisplatina. Em ratos, mesmo entre modelos agudos, há uma grande variabilidade nas doses e formas de administração empregadas. A DL50 de cisplatina nesse gênero é de 12 mg/kg38. Amsallem e Andrieu-Guitrancourt (1985)22 conseguiram mostrar graus mensuráveis de ototoxicidade com doses a partir de 8 mg/kg de CDDP. Dose de até 20 mg/kg em infusão única tem sido vista nos estudos experimentais39. A dose mais comumente empregada como única infusão é a de 16 mg/kg37,38, sendo essa a escolhida para este estudo. Essa dose produz uma rápida absorção e concentrações reprodutíveis de cisplatina no plasma38. O uso da bomba de infusão para administração lenta (30min.) de doses não fracionadas maiores ou iguais a 13 mg/kg torna-se indispensável para diminuir a mortalidade dos animais29.

O fracionamento das doses de CDDP é um mecanismo usado para se conseguir administrar quantidades maiores sem aumento de mortalidade. Li et al. (2001)40 promoveram ototoxicidade em ratos Fisher 344 com uma dose cumulativa de 15 mg, administrada em 3 doses de 5 mg, com intervalos de 3 dias. Hyppolito et al. (2005)30 conseguiram desencadear ototoxicidade com essa droga em cobaias albinas com a dose de 24 mg/kg, fracionada em 3 doses de 8 mg/kg, em 3 dias consecutivos. Todavia não referiram a mortalidade observada entre os animais. Não se viu relatos na literatura revisada do uso desse modelo de administração de CDDP em ratos. Utilizou-se essa dose fracionada neste estudo, observando-se uma sobrevida de  96,97% nos animais avaliados por PAETE no terceiro dia após o início da administração da droga. Essa sobrevida é alta quando comparada à maioria dos modelos animais com cisplatina que referem uma taxa de mortalidade entre 33 e 50%31.

A via de administração intraperitoneal utilizada neste estudo se mostrou efetiva para desencadear a ototoxicidade nas doses utilizadas. Essa é também a via sistêmica de administração vista na maioria dos experimentos de ototoxicidade com CDDP em ratos.

Toxicidade Sistêmica da Cisplatina

Apesar de existirem formas pouco quantificáveis de avaliação da toxicidade sistêmica da cisplatina como a presença de anorexia e diarréia35, deu-se preferência a parâmetros objetivos e mensuráveis como a perda de peso, curva de sobrevida e taxa de sobrevida final.

O peso dos animais diminuiu de forma significativa em relação aos grupos controle a partir de D1 ou D2 com as doses de 24 mg/kg e 16 mg/kg. Notou-se uma perda média em torno de 12% para o D3 e 11% para o D4 com a dose de 24 mg/kg e 14% para o D3 e 15% para o D4 na dose de 16 mg/kg. Também aqui se notou um padrão de perda de peso relativo às duas doses empregadas, onde não foi evidenciada diferença significativa até D3. No D4, animais tratados com a dose de 24mg/kg e que conseguiram sobreviver até o final do experimento, tiveram uma média de perda de peso um pouco menor que aqueles tratados com a dose de 16 mg/kg. Esses dados em conjunto sugerem uma toxicidade sistêmica similar para ambas as doses de cisplatina pelo menos na avaliação de 3 dias. Kamimura et al. (1999)34, utilizando a dose de 16 mg/kg de cisplatina, evidenciaram em ratos Wistar uma perda de peso média, após 3 dias, de 24,5%, portanto maior que a encontrada neste estudo, mas similar ao trabalho de Tanaka, Whitworth e Rybak (2004)29 que relataram uma redução média de 23% no peso dos animais tratados com a dose 13 mg/kg. Ressalte-se que, neste último experimento, houve um trauma cirúrgico adicional pela abertura in vivo da bula auditiva. Avaliando ratos albinos por igual período com uma dose de 12 mg/kg, Sockalingam et al. (2000)35 encontraram perda de peso média de 18,3%, também maior que a máxima perda média vista no presente estudo (14%). Resultado semelhante ao aqui encontrado foi evidenciado no trabalho de Laurell et al. (2000)38 que constaram uma perda média de peso ao longo de 3 dias de 13% em ratos Long-Evans tratados com 16 mg/kg de CDDP. Não foram encontrados estudos com variação do peso relacionado à dose de 24 mg/kg.

A sobrevida dos animais tratados com CDDP 24 mg foi menor que a de seu controle e que a dos animais tratados com 16 mg/kg, às custas do quarto dia após o início das drogas. Entretanto, não foi evidenciada diferença estatística significativa entre as curvas de sobrevida das duas doses de CDDP. Ao se avaliar a taxa de sobrevida final, ela foi maior no D3 quando comparada a D4, embora a análise estatística não tenha mostrado significância. Estes dados sugerem uma toxicidade sistêmica cumulativa da cisplatina ao longo dos dias, com aumento da mortalidade a partir de 96h. Na literatura consultada não se obteve registros da curva de sobrevida dos animais, mas apenas da taxa de sobrevida final. Kamimura et al. (1999)34 relataram uma sobrevida de 43% em 72h com a dose de 16 mg/kg. Já Campbell et al. (1996, 1999)41,42, com os mesmos parâmetros, sobrevida de 50%, Laurell et al. (2000)38 92% e Hatzopoulos et al. (2002)43 100%. Os dados deste estudo, com ambas as doses, mostram uma taxa de mortalidade em 72h menor que aquela da maioria dos modelos animais com cisplatina que varia entre 33 e 50%31.

Potencial auditivo evocado de tronco encefálico (PAETE)

Os potenciais auditivos evocados de tronco encefálico têm sido largamente empregados para estudo da ototoxicidade por cisplatina em roedores 22,28. Entretanto, não há uma padronização da técnica de exame entre os diversos autores.

Neste estudo, conseguiu-se elucidar um traçado de PAETE em ratos Wistar com identificação de 5 a 7 ondas, tendo a onda II a maior amplitude. Para tanto, utilizaram-se eletrodos de platina, em forma de agulha, posicionados na subderme do vértex (eletrodo positivo ou ativo), região retroauricular direita (eletrodo referência ou negativo) e ponta do nariz (eletrodo terra). O eletrodo terra pode se localizar em qualquer posição do corpo sem alterar o traçado. Já posições diferentes dos eletrodos referência e ativo tornam determinadas ondas mais ou menos evidentes. Amsallem e Andrieu-Guitrancourt (1985)22 posicionaram os eletrodos entre o vértex (ativo) e a cauda (referência). Sockalingam et al. (2000)35 entre vértex (positivo) e bochecha (negativo). Li et al. (2001)40 entre vértex (positivo) e musculatura cervical (negativo). Vários autores de um mesmo grupo de pesquisa publicaram estudos posicionando os eletrodos no vértex (positivo) e ponta do nariz (negativo)34. Outros estudos, principalmente os mais recentes, localizaram os eletrodos em pontos de referência semelhantes aos utilizados neste experimento21,28,38. Acredita-se que nos registros clínicos esse posicionamento seja aquele que oferece um traçado ideal do PAETE44.

Há controvérsia em relação a como se determinar o limiar eletrofisiológico através de PAETE em ratos. Em concordância com Amsallem e Andrieu-Guitrancourt (1985)22, este estudo evidenciou ser a onda II em ratos aquela de maior amplitude e a última a desaparecer com a diminuição da intensidade do estímulo sonoro. Portanto, essa onda foi o parâmetro para se determinar o limiar auditivo dos animais.

Apesar de as respostas desencadeadas pelo clique estarem representadas no giro médio da cóclea de ratos e não no giro basal45, local onde predomina a lesão da cisplatina29,31,34, as doses de 16 e 24 mg/kg de cisplatina foram capazes de desenvolver ototoxicidade mensurável por PAETE. O aumento médio do limiar eletrofisiológico para a dose de 24 mg/kg foi de 12 dB NA no D3 e 21 dB NA no D4. Entretanto, não se viu diferença estatística significativa entre D3 e D4. A dose de 16 mg/kg promoveu um aumento médio de limiar de 14,17 dB NA tanto no D3 como no D4, com este último dia de avaliação, apresentando uma maior variabilidade dos limiares secundária à mortalidade aumentada dos animais. Não houve qualquer variação de limiares do PAETE nos grupos controle. O aumento médio de limiar eletrofisiológico para cliques após a infusão de 16 mg/kg de cisplatina e avaliação 72h após variou na literatura entre 15,2 dB43 e 36 dB46. Sockalingam et al. (2000)35 não evidenciaram aumento significativo do limiar para cliques após 3 dias com a dose de 12 mg/kg. Por outro lado, Tanaka, Whitworth e Rybak (2004)29 mostraram um aumento médio de 18,3 dB para a dose de 13 mg/kg. Não se encontraram estudos utilizando PAETE na avaliação auditiva de ratos para doses de 24 mg/kg.

Através do PAETE também se verificou que a lesão auditiva desencadeada pela cisplatina provém de estruturas cocleares, pois não houve aumento significativo do intervalo I-V nos animais tratados. Resultado semelhante foi visto por Rebert, Pryor e Frick (1984)47. Em hamsters, Church et al. (1995)48 acusaram prolongamento do intervalo I-IV com a dose de 15 mg/kg de CDDP, sugerindo lesão retrococlear por essa droga.

Por conseguinte, os potenciais auditivos evocados de tronco encefálico (PAETE), utilizando como estímulo auditivo cliques de rarefação, mostraram-se um método eficaz para detecção da ototoxicidade por CDDP em ratos nas duas doses empregadas.

Experimentos de ototoxicidade por cisplatina e otoproteção são vastamente encontrados na literatura pela necessidade de se estudar os mecanismos envolvidos e promover uma opção terapêutica para as neoplasias malignas que traga consigo menores efeitos adversos ao paciente.

Por fim, espera-se que a padronização de um modelo de avaliação de ototoxicidade do presente estudo contribua para experimentos posteriores, envolvendo, sejam as drogas nele utilizadas, sejam outras drogas cujos mecanismos de lesão e estratégias de otoproteção necessitem ser melhor compreendidos.

 

CONCLUSÕES

 

Dentro do propósito do estudo e tendo como base os resultados obtidos, podemos concluir que:

·   Cisplatina na dose de 16 mg/kg e 24 mg/kg com avaliação antes da administração (D0) e três dias após (D3) através de potenciais auditivos evocados de tronco encefálico constitui-se em um modelo adequado para experimentos de ototoxicidade.

·   Três dias de estudo foram suficientes para as análises de ototoxicidade, uma vez que pode ser detectado sinais de ototoxicidade, com mortalidade baixa dos animais.

 

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Figura 1
Imagem 1
Gr fico representando a varia‡Æo m‚dia ñ EPM do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 1 e 2 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento. Os asteriscos representam diferen‡a estat¡stica significativa em cada dia do grupo estudo (1) em rela‡Æo ao seu controle (2). Teste T: * p = 0,0012 (D2 x D2 controle); ** p < 0,0001 (D3 x D3 controle); *** p = 0,0013 (D4 x D4 controle).

Figura 2
Imagem 2
Gr fico representando a varia‡Æo m‚dia ñ EPM do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 3 e 4 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento. Os asteriscos representam diferen‡a estat¡stica significativa em cada dia do grupo estudo (3) em rela‡Æo ao seu controle (4). Teste T: * p < 0,001 (D2 x D2 controle); ** p < 0,0001 (D3 x D3 controle); *** p < 0,001 (D4 x D4 controle).

Figura 3
Imagem 3
Gr fico representando a varia‡Æo m‚dia ñ EPM do peso, expressa em percentagem, dos animais nos grupos 9 e 10 entre os dias 0 (D0), 1 (D1), 2 (D2), 3 (D3) e 4 (D4) do experimento. O asterisco representa diferen‡a estat¡stica significativa entre o D4 do grupo de 24 mg/kg versus o D4 do grupo de 16 mg/kg (Teste T; * p = 0,0397).

Figura 4
Imagem 4
Curva de sobrevida dos grupos de animais submetidos a PAETE antes (D0) e no terceiro (D3) e quarto dias (D4) ap¢s o in¡cio da administra‡Æo das drogas. O asterisco representa significƒncia estat¡stica. Teste Logrank: * p = 0,0293 (CDDP 24 mg/kg x controle).

Figura 5
Imagem 5
Gr fico dos limiares eletrofisiol¢gicos m‚dios nos grupos 1 e 2 em D0, D3 e D4, expressos como m‚dia ñ erro padrÆo da m‚dia (MED ñ EPM). O asterisco representa diferen‡a estat¡stica significativa. CDDP = cisplatina; C = controle. ANOVA - Tukey: * p < 0,01 (D3 x D0 CDDP); * p < 0,001 (D4 x D0 CDDP).

Figura 6
Imagem 6
Gr fico do intervalo I-V m‚dio dos animais nos grupos 1 e 2 nos dias D0, D3 e D4 expressos como m‚dia ñ erro padrÆo da m‚dia (MED ñ EPM). NÆo foi encontrada diferen‡a estat¡stica entre os dias nos 2 grupos. ANOVA p > 0,05.

Figura 7
Imagem 7
Gr fico dos limiares eletrofisiol¢gicos m‚dios nos grupos 3 e 4 em D0, D3 e D4, expressos como m‚dia ñ erro padrÆo da m‚dia (MED ñ EPM). O asterisco representa diferen‡a estat¡stica significativa. CDDP = cisplatina; C = controle. ANOVA - Tukey: * p < 0,05 (D3 x D0 CDDP).

Figura 8
Imagem 8
Gr fico do intervalo I-V m‚dio dos animais nos grupos 3 e 4 nos dias D0, D3 e D4 expressos como m‚dia ñ erro padrÆo da m‚dia (MED ñ EPM). NÆo foi encontrada diferen‡a estat¡stica entre os dias nos 2 grupos. ANOVA p > 0,05.

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